Вопрос 5. Особенности белкового и углеводного обмена у бактерий

1. Белковый обмен

   Белковый обмен у бактерий – это, с одной стороны, – процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды, а с другой, – внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях, то этот процесс называется гниение, а если он идет в аэробных условиях – тление.
   При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада – пептонов, а при наличии у бактерий пептидаз пептоны расщепляются ими до аминокислот и продуктов их распада (аммиака, сероводорода, индола). Протеолитические (способность расщеплять белки) и пептолитические (способность расщеплять пептоны) свойства выражены далеко не у всех бактерий, поэтому их изучение в совокупности с другими ферментативными свойствами помогает идентифицировать бактерии.

2. Углеводный обмен

   Углеводный обмен у бактерий также носит двоякий характер – это процесс синтеза и распада углеводов. Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях – брожением.
   В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение:
   • спиртовое,
   • молочнокислое,
   • пропионовокислое,
   • муравьинокислое,
   • маслянокислое,
   • уксуснокислое.
   Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение – облигатные анаэробы. Однако некоторые из них – факультативные анаэробы, способны осуществлять процесс брожения в присутствии кислорода, но без его участия. Более того, этот кислород подавляет процесс брожения. И оно сменяется горением (дыханием – конечный акцептор водорода – кислород). Этот эффект был назван эффектом Пастера и является одним из классических примеров смены метаболизма у бактерий в зависимости от условий среды.

3. Типы биологического окисления у бактерий

   Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов – АТФ и АДФ.
   Органеллами дыхания у большинства бактерий являются производные цитоплазматической мембраны – мезосомы, на которых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисления является одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать различные микроорганизмы. По этому признаку выделяют три группы бактерий:
   • первая группа – облигатные аэробы, которые способны получать энергию только путем дыхания и нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.
   • вторая группа – облигатные анаэробы – бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору.
   • третья группа – факультативные анаэробы – бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода, и использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения.
   Среди них могут быть факультативно-анаэробные бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии), а также аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии, которые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (например, молочнокислые бактерии).

Вопрос 6. Рост и размножение. Генетика бактерий

1. Рост и размножение бактерий

   Для микробиологической диагностики, изучения микроорганизмов и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.
   Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур.
   Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином «размножение». Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).
   В отличии от митотического цикла деления у эукариотов, размножение большинства прокариотов (бактерий) идет путем бинарного деления, а актиномицетов – почкованием. При этом все прокариоты существуют в гаплоидном состоянии, поскольку молекула ДНК представлена в клетке в единственном числе.

2. Бактериальная популяция. Колония

   При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. В этом процессе выделяют 4 фазы:
   • 1-я – начальная, или лаг-фаза, или фаза задержки размножения, она характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;
   • 2-я – логарифмическая, или лог-фаза, или экспоненциальная фаза, она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;
   • 3-я – стационарная фаза, она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;
   • 4-я – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.
   Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами.
   Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использование синхронных культур. Синхронные культуры – культуры бактерий, все члены популяции которых находятся в одной фазе цикла. Это достигается с помощью специальных методов культивирования, однако через несколько одновременных делений синхронизированная клеточная суспензия постепенно снова переходит к асинхронному делению, так что число клеток увеличивается в дальнейшем уже не ступенчато, а непрерывно.
   При культивировании на плотных питательных средах бактерии образуют колонии. Это – видимое невооруженным глазом скопление бактерий одного вида, являющееся чаще всего потомством одной клетки. Колонии бактерий разных видов отличаются:
   • формой,
   • величиной,
   • прозрачностью,
   • цветом,
   • высотой,
   • характером поверхности,
   • краев,
   • консистенцией.
   Характер колоний – один из таксономических признаков бактерий.

3. Генетика бактерий

   Важнейшим признаком живых организмов являются изменчивость и наследственность. Основу наследственного аппарата бактерий, как и всех других организмов, составляет ДНК (у РНК-содержащих вирусов – РНК).
   Наряду с этим наследственный аппарат бактерий и возможности его изучения имеют ряд особенностей. Прежде всего, бактерии – гаплоидные организмы, т. е. они имеют одну хромосому. В связи с этим при наследовании признаков отсутствует явление доминантности. Бактерии обладают высокой скоростью размножения, в связи с чем за короткий промежуток времени (сутки) сменяется несколько десятков поколений бактерий. Это дает возможность изучать огромные по численности популяции и достаточно легко выявлять даже редкие по частоте мутации.
   Наследственный аппарат бактерий представлен хромосомой. У бактерий она одна. Если и встречаются клетки с двумя, четырьмя хромосомами, то они одинаковые. Хромосома бактерий – это молекула ДНК. Длина этой молекулы достигает 1,0 мм и, чтобы «уместиться» в бактериальной клетке, она не линейная, как у эукариотов, а суперспирализована в петли и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране.
   На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены. У кишечной палочки, например, их более 2 тысяч. Однако генотип (геном) бактерий представлен не только хромосомными генами. Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов являются IS-последовательности, транспозоны и плазмиды.

Вопрос 7. Функциональные единицы генома. Изменчивость бактериальной клетки

1. Функциональные единицы генома

   IS-последовательности – короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). IS-последовательности одинаковы у разных бактерий.
   Транспозоны. Это молекулы ДНК – более крупные, чем IS-последовательности. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген, кодирующий тот или иной признак. Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии как их собственных структурных генов, так и соседних хромосомных. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы, автономно, но не способны к автономной репликации.
   Плазмиды это кольцевые суперспиралевидные молекулы ДНК. Их молекулярная масса колеблется в широких пределах и может быть в сотни раз больше, чем у транспозонов. Плазмиды содержат структурные гены, наделяющие бактериальную клетку разными, весьма важными для нее свойствами:
   • R-плазмиды – лекарственной устойчивостью,
   • Col-плазмиды – синтезировать колицины,
   • F-плазмиды – передавать генетическую информацию,
   • Hly-плазмида – синтезировать гемолизин,
   • Tox-плазмида – синтезировать токсин,
   • плазмиды биодеградации – разрушать тот или иной субстрат и другие.
   Плазмиды могут быть интегрированы в хромосому (в отличие от IS-последовательностей и транспозонов, встраиваются в строго определенные участки), а могут существовать автономно. В этом случае они обладают способностью к автономной репликации, и именно поэтому в клетке может быть 2, 4, 8 копий такой плазмиды.
   Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плазмиды называются трансмиссивными.

2. Фактор фертильности

   Наличие F-плазмиды (фактор фертильности, половой фактор) придает бактериям функции донора, и такие клетки способны передавать свою генетическую информацию другим, F-клеткам. Таким образом, наличие F-плазмиды является генетическим выражением пола у бактерий. С F-плазмидой связана не только донорская функция, но и некоторые другие фенотипические признаки. Это, в первую очередь, наличие F-пилей (половых ресничек), с помощью которых и устанавливается контакт между донорскими и реципиентными клетками. Через их канал и передается донорская ДНК при рекомбинации. На половых ресничках расположены рецепторы для мужских fi-фагов. F-клетки не имеют таких рецепторов и не чувствительны к таким фагам.
   Таким образом, наличие F-ресничек и чувствительность к fi-фагам можно рассматривать как фенотипическое выражение (проявление) пола у бактерий.

3. Изменчивость

   У бактерий различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую.
   Фенотипическая изменчивостьмодификации – не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковременные модификации) число поколений.
   Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации.
   Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления, так как имеется возможность работать с большими по численности популяциями бактерий. По происхождению мутации могут быть:
   • спонтанными,
   • индуцированными.
   По протяженности:
   • точечные,
   • генные,
   • хромосомные мутации.
   По направленности:
   • прямые,
   • обратные мутации.
   Рекомбинации у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот:
   • Во-первых, у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций (обмена генетическим материалом).
   • Во-вторых, при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эукариот, а мерозигота (несет полностью генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения).
   • В третьих, при рекомбинациях у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации.
   Трансформация – это обмен генетической информацией у бактерий путем введения в бактериальную клетку-реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредственно выделенного из клетки-донора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора.
   Для восприятия донорской ДНК при трансформации клетка-реципиент должна находится в определенном физиологическом состоянии (компетентности), которое достигается специальными методами обработки бактериальной популяции. При трансформации передаются единичные (чаще один) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.
   Трансдукция – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих) бактериофагов.
   Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов (признаков). Трансдукция бывает:
   • специфической (переносится всегда один и тот же ген),
   • неспецифической (передаются разные гены).
   Это связано с локализацией трансдуцирующих фагов в геноме донора. В первом случае они располагаются всегда в одном месте хромосомы, во втором – их локализация непостоянна.
   Конъюгация – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте.
   После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположения генов на хромосоме бактерий – построить хромосомные карты бактерий (картирование бактерий). Донорской функцией обладают F+ клетки.

Вопрос 8. Нормальная микрофлора тела человека

1. Понятие о микробиоценозе

   Нормальная микрофлора сопутствует своему хозяину на протяжении всей его жизни. О существенном ее значении в поддержании жизнедеятельности организма свидетельствуют наблюдения за животными-гнотобионтами (лишенными собственной микрофлоры), жизнь которых существенно отличается от таковой нормальных особей, а порою просто невозможна. В этой связи учение о нормальной микрофлоре человека и ее нарушениях представляет собой весьма существенный раздел медицинской микробиологии.
   В настоящее время твердо установленным является положение о том, что организм человека и населяющие его микроорганизмы – это единая экосистема. С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным видовым составом и занимающих тот или иной биотип в организме. В любом микробиоценозе следует различать постоянно встречающиеся виды микроорганизмов – характерные (индигенная, автохтонная флора), добавочные и случайные – транзиторные (аллохтонная флора). Количество характерных видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно. Видовой состав транзиторных микроорганизмов разнообразен, но они немногочисленны.
   Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани (кожу, слизистые оболочки), во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы. Сформировавшийся микробиоценоз существует как единое целое, как сообщество объединенных пищевыми цепями и связанных микроэкологией видов.
   Совокупность микробных биоценозов, встречающихся в организме здоровых людей, составляет нормальную микрофлору человека. В настоящее время нормальную микрофлору рассматривают как самостоятельный экстракорпоральный орган. Он имеет характерное анатомическое строение (биопленка) и ему присущи определенные функции. Установлено, что нормальная микрофлора обладает достаточно высокой видовой и индивидуальной специфичностью и стабильностью.

2. Особенности нормальной микрофлоры

   Нормальная микрофлора отдельных биотопов различна, но подчиняется ряду основных закономерностей:
   • она представлена несколькими видами, среди которых выделяют доминантные виды и виды-наполнители;
   • преобладающими являются анаэробные бактерии;
   • она образует биопленку;
   • нормальная микрофлора достаточно стабильна.
   Нормальная микрофлора характеризуется анатомическими особенностями – каждая экологическая ниша имеет свой видовой состав. Некоторые биотопы стабильны по своему составу, а другие (транзиторная микрофлора) постоянно меняется в зависимости от внешних факторов.
   Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, образуют четкую морфологическую структуру – биопленку, толщина которой колеблется от 0,1 до 0,5 мм. Биопленка представляет собой полисахаридный каркас, состоящий из микробных полисахаридов и муцина, который продуцирует клетки макроорганизма. В этом каркасе иммобилизованы микроколонии бактерий – представителей нормальной микрофлоры, которые могут располагаться в несколько слоев. В состав нормальной микрофлоры входят как анаэробные, так и аэробные бактерии, соотношение которых в большинстве биоценозов составляет 10:1—100:1.
   Заселение бактериями различных областей тела начинается в момент рождения человека и продолжается на протяжении всей его жизни. Формирование качественного и количественного состава нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов. Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависимости от:
   • возраста,
   • условий внешней среды,
   • условий труда, рациона питания,
   • перенесенных заболеваний,
   • травм и стрессовых ситуаций.
   В составе нормальной микрофлоры различают:
   • постоянную, или резидентную микрофлору, которая представлена относительно стабильным составом микроорганизмов, обычно обнаруживаемых в определенных местах тела человека у людей определенного возраста;
   • транзиторную, или временную микрофлору, которая попадает на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывая заболеваний и не обитая постоянно на поверхностях тела человека. Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель. Присутствие транзиторной микрофлоры определяется не только поступлением микроорганизмов из окружающей среды, но и состоянием иммунной системы организма хозяина и составом постоянной нормальной микрофлоры.
   В норме многие ткани и органы здорового человека свободны от микроорганизмов, т. е. являются стерильными. К ним относятся:
   • внутренние органы,
   • головной и спинной мозг,
   • альвеолы легких,
   • внутреннее и среднее ухо,
   • кровь, лимфа, спинномозговая жидкость,
   • матка, почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре.
   Это обеспечивается наличием неспецифических клеточных и гуморальных факторов иммунитета, препятствующих проникновению микробов в эти ткани и органы.
   На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях формируется достаточно стойкая микрофлора, специфичная для данного органа, биотопа или его участка эпитопа. Наиболее богаты микроорганизмами:
   • ротовая полость,
   • толстый кишечник,
   • верхние отделы дыхательной системы,
   • наружные отделы мочеполовой системы и кожа, особенно ее волосистая часть.

Вопрос 9. Нормальная микрофлора кожи и верхних дыхательных путей

1. Нормальная микрофлора кожи

   Вследствие постоянного контакта с внешней средой кожа чаще всего становится местом обитания транзиторных микроорганизмов. Тем не менее, имеется стабильная и хорошо изученная постоянная микрофлора, состав которой различен в разных анатомических зонах в зависимости от содержания кислорода в окружающей бактерии среде (аэробы – анаэробы) и близости к слизистым оболочкам (рот, нос, перианальная область), особенностей секреции, и даже одежды человека.
   Особенно обильно заселены микроорганизмами те области кожных покровов, которые защищены от действия света и высыхания:
   • подмышечные впадины,
   • межпальцевые промежутки,
   • паховые складки,
   • промежность.
   При этом на микрорганизмы кожных покровов воздействуют бактерицидные факторы сальных и потовых желез.
   В составе резидентной микрофлоры кожи и слизистых оболочек присутствуют:
   Staphylococcus epidermidis,
   Staphylococcus aureus,
   Micrococcus spp.,
   Sarcina spp.,
   коринеформные бактерии,
   Propionibacterium spp.
   В составе транзиторной:
   Streptococcus spp.,
   Peptococcus spp.,
   Bacillus subtilis,
   Escherichia coli,
   Enterobacter spp.,
   Acinetobacter spp.,
   Lactobacillis spp.,
   Candida albicans и многие другие.
   В зонах, где имеются скопления сальных желез (гениталии, наружное ухо), встречаются кислотоустойчивые непатогенные микобактерии. Наиболее стабильной и в то же время очень удобной для изучения является микрофлора области лба.
   Значительное большинство микроорганизмов, в том числе и патогенных, не проникает через неповрежденные кожные покровы и погибает под воздействием бактерицидных свойств кожи. К числу таких факторов, которые могут оказывать существенное влияние на удаление непостоянных микроорганизмов с поверхности кожи, относятся:
   • кислая реакция среды,
   • наличие жирных кислот в секретах сальных желез и присутствие лизоцима.