Страница:
суммарную тРНК. Затем в пробирке ("in vitro") вели ее дометилирование - в
пробирку вносили суммарную белковую фракцию из другого источника. В ней
наряду с прочими ферментами были и метилазы. Разумеется, туда же добавляли с
запасом и 14С-SAM. Инкубировали несколько часов при
37оС. Выделяли из смеси суммарную тРКН, уже меченную
радиоактивным метилом (из 14С-SAM). Проводили полное расщепление
всех тРНК до нуклеиновых оснований. (Обработка 65%-ной хлорной кислотой в
запаянной ампуле 1,5 часа при 100оС). Разделение всех нуклеиновых
оснований производили методом колоночной хроматографии. Положение "пиков"
всех нормальных нуклеиновых оснований на хроматограмме было заранее
определено по ультрафиолетовому поглощению в тех же условиях разделения.
Метилированные миноры выходили из колонки отделенными от четырех нормальных
оснований. Положение "пиков" миноров, зафиксированное по радиоактивности, на
всех хроматограммах было неизменным. Активность соответствующих метилаз
оценивали по величине радиоактивности, измеренной в каждом из "пиков"
соответствующих миноров.
В результате было обнаружено, что относительная активность различных
метилаз (производящих разные миноры) зависит от выбора их источника: мы
сравнивали нормальную бактерию E.coli, печень крысы, гепатому Новикова,
молочную железу коровы. Еще зависит от степени кислотности инкубационной
среды, от концентрации в ней ионов магния и от соотношения количеств тРНК и
ферментной фракции. Вплоть до 6 часов инкубации включение радиоактивного
метила увеличивалось пропорционально времени. Все опыты дублировались для
проверки воспроизводимости результатов. Для каждого из источников метилаз на
основании этих опытов определяли оптимальные условия инкубации in vitro.
Описанные опыты заняли у нас с Полиной два года, 71-й и 72-й.
Покончив с этим довольно значительным объемом работ, я счел поручение
заведующего лабораторией выполненным (впрочем, его это уже не интересовало)
и начал готовиться к экспериментам по проверке своей гипотезы.
Но сначала небольшое отступление в сторону.
Я не случайно упомянул об утрате Баевым всякого интереса к метилазам.
После своего щедро вознагражденного триумфа его группа за прошедшие с тех
пор два года развалилась. Еще в 68-м году Ученый секретарь президиума
Академии наук Г.К. Скрябин, совмещавший эту должность с руководством
Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов в недавно созданном научном
городке Пущино (близ Серпухова), предложил Баеву организовать в нем
биохимическую лабораторию. Скрябина и Баева к этому времени связывали тесные
дружеские отношения. Предложение было принято. Александр Александрович
получил в Пущине большую квартиру и значительную часть времени проводил там,
на лоне природы. К тому же в 71-м году он был избран академиком-секретарем
Отделения биофизики и биохимии Академии, что также отнимало у него немало
времени. В ИМБ он заглядывал редко.
Самый сильный сотрудник команды, расшифровавшей структуру тРНК, Андрей
Мирзабеков, повозился с ней еще с полгода, стараясь выяснить функции
отдельных фрагментов этой молекулы. Потом отбыл на длительную стажировку в
Англию. Вернулся, увлеченный совсем иной проблемой - пространственной
организацией ДНК у высших животных. По-видимому, с согласия Баева, для
которого столь сильный сотрудник да еще с малознакомой ему тематикой был
неудобен, Андрей отделился и возглавил свою собственную лабораторию.
Татарская и Аксельрод эмигрировали. "Рабочие лошадки" - лаборантки вслед за
Баевым перебрались в Пущино, где тоже получили жилье. Из всей славной
команды, занимавшейся строением тРНК, осталась одна Татьяна Владимировна
Венкстерн. Будучи человеком уже пожилым, привыкшим всю жизнь работать под
авторитетным руководством - то Энгельгардта, то Баева, она не попыталась
найти для себя какое-то новое направление исследований. Как всеми уважаемый
и давний сотрудник директора Института, она взяла на себя заботу об
иностранных научных связях, организацию международных симпозиумов и
конференций.
Между тем в 72-м году появилась публикация американских ученых о первых
успехах получения "рекомбинантных ДНК". Это было начало эпохи "генной
инженерии". Суть этого направления в том, что был найден способ "разрезания"
в заранее определенном месте двойной спирали молекулы ДНК одной бактерии и
вживления в разрез фрагмента ДНК из другой бактерии - какого-нибудь ее гена.
Например, в ДНК безобидной обитательницы желудка человека, "кишечной
палочки", можно было надеяться встроить смертоносный ген бактерии чумы. Всем
было ясно, что это путь создания необоримого оружия биологической войны.
Кишечная палочка сохраняла свой "внешний облик" и потому была неотличима и
неуязвима для собственной иммунной системы человека. До того момента, пока
спрятанный в ее ДНК смертоносный ген не обнаруживал себя выработкой
страшного яда. Работы в этом направлении должны были получить неограниченную
финансовую поддержку от министерств обороны как у нас, так и в США. Авторы,
открывшие возможность генной инженерии, понимали к каким губительным
последствиям может привести их открытие. Они предложили наложить запрет на
развитие этих работ до тех пор, пока человечество не будет к этому морально
подготовлено. Сами объявили, что прекращают свои исследования. Но не тут-то
было! Ученые рангом ниже тут же вцепились в генную инженерию. В том числе и
Баев. Предлагал и мне заняться генной инженерией. Но, понимая, что это -
подготовка бактериологического оружия, я категорически отказался. После чего
наши отношения стали натянутыми.
Вообще, за последние несколько лет Александр Александрович стал
неузнаваем. Исчезло с лица выражение неизменной доброжелательности, исчезла
готовность помочь всем и каждому. Следа не осталось от приветливой, так
располагавшей к нему улыбки. Время от времени в кабинете заведующего
лабораторией появлялся мрачноватого вида, сухой и желчный начальник,
чиновник высокого ранга. К счастью, на меня он не обращал никакого внимания.
Дело ограничивалось легким кивком при случайной встрече в коридоре.
Как можно было объяснить эту метаморфозу? То ли на него столь роковым
образом повлияло высокое служебное положение, почет и власть, с ним
связанные, то ли его былые доброта и обаяние были лишь маской, надетой еще
во время пребывания "в местах отдаленных". В пользу второго предположения
могло говорить то, что выяснилось из его посмертно опубликованной биографии.
Ни на лесоповале, ни в шахте, ни на каких-либо еще тяжелых работах он
никогда не был. Три года отсидки в вологодской и соловецкой тюрьмах, а потом
работал врачом. Сначала в Норильском лагере, потом в больнице Норильского
металлургического комбината. Во время второй ссылки в течение пяти лет
заведывал сельской больницей в Красноярском крае.
Возможно также, что он так изменился под воздействием страха, который
ему пришлось пережить (все еще улыбаясь) в 68-м году. Работа по расшифровке
структуры тРНК подходила к концу. Радужные перспективы славы и почета,
наверное, уже рисовало воображение ее руководителя, когда случилось
вторжение советских войск в Чехословакию. В связи с ним семеро диссидентов,
чьи имена были названы в газетах, вышли на Красную площадь и развернули
плакат с протестом против этого вторжения. Они были немедленно арестованы.
Но никто не знал тогда, что их было не семь, а восемь. Восьмой была дочь
Александра Александровича Баева. Это обстоятельство в один миг могло
оборвать восхождение на академический Олимп в то время еще малоизвестного
кандидата наук. Но чья-то могучая рука вычеркнула юную протестантку из
"преступного" списка. Нет сомнения, что эту руку мог направить (конечно, не
непосредственно) только Энгельгардт. Вероятно, в течение какого-то времени
дело находилось в подвешенном состоянии и Баев, как говорится, натерпелся
страху.
Тем более, что он уже с 64-го года был членом КПСС. В своей
автобиографии, написанной за год до смерти, в 93-м году, Александр
Александрович объясняет мотивы своего поступка. Мне они показались столь
любопытными, что я решил воспроизвести их здесь.
"Сколько неприятностей и затруднений я испытал в 20-е годы из-за
имеющего формальное значение факта, что отец мой был не рабочим, не
крестьянином, а адвокатом. В 1954 году с меня сняли обвинение в терроризме,
но это была реабилитация судебная. Не существовало полной уверенности, что в
какой-то момент партийные или общественные круги не придут к заключению, что
судебная реабилитация полностью не обеляет лиц с прошлым, подобным моему.
Легко можно придумать даже несколько вариантов обоснования такого мнения. Ни
идеологических, ни карьерных мотивов у меня не было, когда я получил красную
книжку как свидетельство благонадежности. Я хотел крошечной свободы,
возможности жить, как это меня устраивало. В нашей стране деспотический
режим узурпировал у людей право на жизнь. И тот, кто хотел жить и
действовать, должен был это право купить за ту или иную цену. Здесь не место
заниматься вопросом, чему равна эта цена и следует ли ее платить. Для меня в
1964 г. этой ценой было вступление в партию. Можно по-разному судить о моем
поступке, но я заплатил этот выкуп. Конечно, во всем сказанном звучат нотки
самооправдания, от этого не уйти".
"Академик Александр Александрович Баев"
М.: "Наука", 1997, с. 29.
Но я, кажется, слишком отвлекся. Пора вернуться к моим научным делам.
Итак, в сложившейся ситуации я был совершенно свободен делать все, что мне
угодно, но ни на чью поддержку рассчитывать не мог.
Теперь уместно будет изложить в общих чертах мою гипотезу. Она должна
была ответить на три вопроса, оставшихся без внимания ученых:
Каким образом происходит необходимая смена ферментов в покоящихся
клетках высших организмов?
Используется ли как-нибудь избыточность генетического кода?
Какую роль играют минорные нуклеотиды в тРНК?
Первый вопрос нуждается в пояснении. Описанный ранее прямой путь
передачи информации от гена в ДНК через информационную РНК к рибосоме был
хорошо изучен у бактерий. Напомню, что ДНК бактерии относительно свободно
умещается в ее клетке, не образуя многократно скрученных, тугих структур,
входящих в состав хромосом высших животных. Изменение состава питательных
веществ, попадающих извне в любую клетку, или изменение ее состояния в ходе
развития и специализации требует быстрой смены ферментов, работающих в ее
цитоплазме. У бактерий это происходит просто. Приходящий извне химический
"сигнал" запускает считывание РНК-полимеразой легкодоступного нужного гена.
Информационная РНК приносит копию гена к рибосоме. Немедленно начинается
синтез нужного фермента, позволяющего усвоить принесенное кровью новое
питательное вещество. Операция повторяется до тех пор, пока в клетке не
окажется достаточное количество этого фермента. Если в силу смены питания он
и соответствующая ему информационная РНК оказываются ненужными, они
разрушаются другими ферментами, специально существующими для этой цели в
клетке. На их место поступают другие, нужные в новых условиях информационные
РНК и ферменты.
Такая же смена должна происходить в клетках высших животных, хотя бы по
причине изменения потребляемой пищи. Но добираться каждый раз до глубоко
спрятанного в плотной упаковке ДНК нужного гена у этих организмов слишком
трудно.
Отсюда первое предположение моей гипотезы состояло в том, что в
нормальных условиях существования клеток высшего организма, в длительном
покое, все могущие потребоваться информационные РНК уже находятся в
цитоплазме. Они синтезируются и выходят в нее из ядра во время деления
клетки, когда структура ДНК расслаблена. В цитоплазме эти информационные РНК
хранятся до момента их использования защищенные специальными белками от
ферментов-разрушителей ("чистильщиков"). Подобные структуры, названные
"информосомами", были обнаружены в начале 70-х годов. Для решения задачи
временной наработки большого количества какой-то одной из информационных РНК
я вынужден был предположить возможность копирования информационных РНК, то
есть синтеза РНК по матрице РНК. (Такой вид матричного синтеза обнаружен
совсем недавно.)
Что касается второго вопроса - возможности использования избыточности
генетического кода, то она может послужить клетке высшего организма для
регулирования относительной скорости синтеза различных белков. На уровне
"прочтения" в рибосоме последовательности нуклеотидов, доставленной
информационной РНК.
Дело в том, что избыточность генетического кода оказалась далеко не
равномерной. Когда я писал ранее, что для кодирования 20 аминокислот
остается 61 кодон, можно было предположить, что, как правило, каждой
аминокислоте соответствуют три кодона. Но это не так. Три аминокислоты
"имеют" по 6 кодонов каждая. Пяти другим аминокислотам соответствует по 4
кодона. На долю остальных 12 аминокислот остается 23 кодона. И все они
"разобраны", то есть кодируют аминокислоты - в большинстве случаев по два
кодона на каждую.
Кстати, это обозначает и избыточность числа различных тРНК. Их должно
быть как минимум столько же, сколько "активных" кодонов, то есть 61.
Транспортные РНК, приносящие одну и ту же аминокислоту к разным кодонам
называют "изоакцепторными тРНК" для этой аминокислоты. (Они все присоединяют
к своему концу - "акцептируют" одну и ту же аминокислоту.) Прошу читателя
запомнить смысл этого названия изоакцепторные тРНК. В дальнейшем мы часто
будем иметь с ними дело.
Теперь к существу гипотезы. Предположим, к примеру, что аминокислота
"серин", у которой 6 различных кодонов, в информационной РНК,
предназначенной для синтеза некоего белка А, закодирована одним из этих
шести кодонов (присвоим ему No 1). Если в цитоплазме клетки отсутствует
"зрелая" изоакцепторная тРНК серина, способная "узнать" этот кодон (или ее
очень мало), то синтез белка А окажется невозможен (или чрезвычайно
замедлится). Наш "злополучный" кодон No 1 будет играть роль "модуляторного
кодона", постулированного Эймсом и Хартманом. Во всех прочих белках серин
может быть закодирован любым из остальных пяти его кодонов. И если для них
имеются в достаточном количестве зрелые изоакценпторные тРНК, то все эти
белки будут синтезироваться с нормальной скоростью. Впрочем, поскольку у
серина целых 6 кодонов, замедление может в разной степени коснуться
нескольких белков - получается целая гамма скоростей синтеза
серин-содержащих белков, управляемая пропорцией наличествующих в клетке
дееспособных ("зрелых") изоакцепторных тРНК серина.
Те же "игры" могут разыгрываться для белков, использующих другие
избыточные кодоны, для других аминокислот.
Для завершения рабочей гипотезы (и ответа на 3-й вопрос) остается
предположить, что "зрелость", дееспособность любой тРНК определяется
полнотой ее "миноризации", полнотой набора "положенных ей" миноров. Мы
знаем, что первоначально тРНК синтезируется как цепочка нормальных
нуклеотидов. Миноризация происходит потом, в цитоплазме, благодаря
активности метилаз и других модифицирующих ферментов. Это означает, что
управление скоростями биосинтеза ферментов и прочих белков переносится на
уровень соотношения активностей различных метилаз и других модификаторов.
(Число их должно отвечать числу разных тРНК и необходимому количеству
модификаций в каждой из них.) Но активизация или угнетение активности
различных ферментов может зависеть от веществ, поступающих в клетку извне,
из крови. Например, необходимых низкомолекулярных "помощников" ферментов.
Иногда эту роль играют ионы определенных металлов или простые молекулы
некоторых витаминов.
Подтверждение этой гипотезы открыло бы колоссальные новые перспективы
для медицины, поскольку многие заболевания связаны с нарушениями пропорций
биосинтеза белков в клетках, определяющих функционирование важных для
жизнеспособности органов. А иногда причиной болезни может служить отсутствие
синтеза некоего белка или наоборот - синтез белка вредного. Гипотеза дает
надежду на возможность управления всеми этими отклонениями от нормы извне,
через кровь или лимфу. Притом не чисто эмпирически, а сознательно:
воздействуя на активность модифицирующих тРНК ферментов. (Разумеется, для
этого они должны быть выделены и изучены.)
Но каким образом полнота "миноризации" молекулы тРНК может влиять на ее
дееспособность? Ответ, по-видимому, надо искать в механизме взаимодействия
несущей аминокислоту тРНК с рибосомой. Уже упоминалось, что молекулы тРНК
складываются и приобретают некую пространственную конфигурацию. В ее
образовании должны играть свою роль миноры. Сама же эта конфигурация может
быть необходима для того, чтобы занять нужную позицию на рибосоме. Из этого
предположения неявно вытекает еще и возможность того, что сама рибосома
"дышит" - слегка меняет конфигурацию "места узнавания" в зависимости от
приходящего в него кодона. Недаром же рибосома представляет столь сложное
образование (в нее входит несколько десятков белков и специальные
"рибосомные РНК").
Вот такова гипотеза. Но как приступить к поиску ее подтверждения?
В первую очередь надо было найти объект исследования, который можно
изучать в двух физиологически различных состояниях с тем, чтобы сравнить
наборы изоакцепторных тРНК в каждом из них. Затем можно было бы провести
реакцию синтеза белков in vitro, совмещая в ней информационную РНК и
ферментную систему из одного состояния с набором всех тРНК из другого
состояния. Проанализировать весь спектр белков, синтезируемых в такой
гетерогенной системе, и сравнить его с наборами белков, синтезируемых в
гомогенных системах, когда информационные РНК, ферменты и тРНК были бы взяты
из одного и того же состояния. Быть может, таким образом удалось бы
показать, что набор синтезируемых белков действительно определяется набором
дееспособных тРНК.
К счастью, такой во всех отношениях удобной объект уже существовал и
физиологически был хорошо изучен. Его за несколько лет до того отыскал
заведующий одной из лабораторий Института биологии развития, молодой, но
очень талантливый исследователь Саша Нейфах. Я был с ним хорошо знаком.
Этим объектом служила маленькая рыбка вьюн, похожая на очень короткого
(не более 30 см в длину) угря. Вьюны водятся в нашей средней полосе,
особенно в старицах рек и в других неглубоких и стоячих водоемах. Их Саше
пару раз в месяц привозил в двух больших бидонах (самцы и самки отдельно)
очень колоритный, высокий и жилистый старик. Он знал. наверное, все места в
центральной России, где водится вьюн. Держал их в секрете. Теперь и я стал
его клиентом. В оплату за труды старика зачислили в Институт лаборантом.
Вьюны предпочитают температуру не выше 20оС. Я их хранил в
нескольких больших пластмассовых баках для белья, штук по 50 в каждом, в
"холодной комнате" при +4оС. Там они благополучно дремали до
очередного опыта. Кормить их не было нужды - только ежедневно менять воду.
Отработанная Нейфахом процедура получения оплодотворенной икры была
достаточно простой. Самкам вкалывали половой гормон хориогонин и через 39
часов пребывания при температуре +17оС легко выдавливали из них
икру в плоскую и неглубокую стеклянную чашку с небольшим количеством воды.
Заблаговременно, вспоров брюшко у самцов, извлекали семенники, нарезали их
на мелкие кусочки, которые раздавливали в ступке с несколькими миллилитрами
слабого солевого раствора. В чашку с икрой через смоченную водой марлю
выдавливали экстракт из семенников. При осторожном перемешивании происходило
оплодотворение - икра явно набухала... Далее Саша следил за ранним развитием
зародышей в тех же чашках, помещая их в термостат при температуре
21,5оС. Время от времени чашки покачивали для улучшения аэрации.
Уже через 2 часа в бинокулярную лупу можно было видеть, как на поверхности
икринки появлялся первый "пузырек". Затем он делился надвое, потом еще
деление и так далее. На икринке нарастает "шапочка" (бластодерма). Это уже
зародыш. В течение первых 20 часов он проходит ранние стадии развития
(морула - бластула - гаструла). На глаз это заметно как увеличение
бластодермы и уменьшение размеров образующих ее клеток. Считается, что через
20 часов в зародыше начинаются процессы "органогенеза". Я не пытался
вникнуть в тонкости физиологической эволюции зародыша. Мне было достаточно
уверенности в том, что по мере его развития в клетках бластодермы начинают
синтезироваться новые, характерные для каждой последующей стадии белки. Эту
уверенность разделял и Нейфих. Открывалась возможность обнаруживать
изменения белкового состава и наборов тРНК в зародышах с разных стадий
развития.
Не устраивали меня только масштабы работы Нейфаха. Ему для наблюдений
достаточно было располагать икрой из трех-четырех рыб. А мне для
осуществления последующих операций фракционирования белков и тРНК надо было
запускать в процесс одновременного развития икру из, по меньшей мере,
полусотни рыб. Выращивание зародышей на чашках для этого не годилось. Из
нижней половины разрезанной стеклодувом 20-литровой бутылки от реактивов,
настольного малогабаритного вентилятора, жидкостного термостата и некоторых
вспомогательных устройств мне удалось соорудить прибор, в котором благодаря
непрерывной циркуляции 10 литров взвеси икринок в воде происходило
нормальное развитие зародышей. (Как ни странно, повторить эту конструкцию не
удалось никому, даже Нейфаху - у них икра не росла.)
Не буду описывать процедуры отделения и очистки бластодерм любой стадии
развития от "желтка" - самой икринки с ее запасом питательных веществ. Все
эти процедуры были отработаны Нейфахом. Важно то, что в результате удавалось
получить (в зависимости от стадии развития) от 2 до 5 грамм зародышевого
материала. Этого было достаточно для проведения всех многочисленных и тонких
операций по вскрытию клеток зародыша, извлечению из них нужных фракций,
постановке опытов in vitro и последующего анализа результатов этих опытов.
Ограничусь замечанием, что отработка всех методик и проведение самих
экспериментов потребовали от меня и моих двух лаборанток напряженной работы
в течение девяти лет. После чего постараюсь вкратце изложить полученные
результаты, разбив всю работу на три этапа.
Поскольку методика сопоставления активностей метилаз из разных
источников была уже отработана, решено было провести сравнительную оценку
активностей метилаз из разных органов вьюна и его зародышей на 10-часовой и
30-часовой стадиях развития. Соотношения этих активностей оказались бы
полезными на заключительной стадии исследования роли тРНК в регулировании
биосинтеза белков.
Полученные результаты обнаружили, что соотношения активностей
соответствующих метилаз для печени, сердца и мозга вьюна, а также его
зародышей сильно различаются между собой. Повторенный в эти же дни анализ
распределения активностей для печени крысы оказался совсем иным, чем для
печени вьюна.
Методически опыты ставились так же, как описано ранее: субъектом
метилирования служила суммарная тРНК из "дефицитных" по синтезу метильной
группы бактерий E.coli K12W6(CH3-). Радиоактивный метил включался
за счет того же 14С-SAM.
В другой серии опытов прослеживали динамику изменения активности
метилаз в зародышах вьюна в зависимости от времени их развития. Сопоставляли
стадии: 4,5; 7; 12; 20 и 27 часов роста. Различия в распределении
активностей метилаз были не столь резкими, как для разных тканей взрослого
вьюна, но заметные. При этом для некоторых метилаз можно было усмотреть
определенную постепенность изменения активности от одной стадии развития
зародыша к другой.
Обнаружение отличия в распределении активностей разных метилаз из
тканей одного и того же животного и тем более, его зародышей на разных
стадиях развития свидетельствовало в пользу предложенной гипотезы, но никак
еще не доказывало ее правильность.
Этот этап занял тоже около двух лет: 73-й и 74-й годы.
Любезный читатель, здесь я еще раз позволю себе небольшое отклонение от
темы. Неумолимая хронология заставляет меня отложить на время описание наших
исследований и отдать дань событию, случившемуся в нашей лаборатории в том
же 74-м году. Событие это повлияло не только на мою собственную судьбу, но и
на судьбу всего нашего Института.
В один прекрасный день Александр Александрович Баев сообщил нам, что
вскоре в лаборатории появится новый сотрудник, Костя Скрябин, сын
академика-секретаря президиума Академии наук (и, как я уже упоминал,
близкого друга Баева). Эта новость была с тревогой воспринята почти всеми
сотрудниками, еще остававшимися в лаборатории. К "барскому сыночку" они
заранее питали недоверие и неприязнь. Мне это казалось несправедливым.
"Костя не виноват, что родился в столь высокопоставленной семье, - убеждал я
моих коллег. - Быть может, он отличный парень. Давайте примем его дружески,
пробирку вносили суммарную белковую фракцию из другого источника. В ней
наряду с прочими ферментами были и метилазы. Разумеется, туда же добавляли с
запасом и 14С-SAM. Инкубировали несколько часов при
37оС. Выделяли из смеси суммарную тРКН, уже меченную
радиоактивным метилом (из 14С-SAM). Проводили полное расщепление
всех тРНК до нуклеиновых оснований. (Обработка 65%-ной хлорной кислотой в
запаянной ампуле 1,5 часа при 100оС). Разделение всех нуклеиновых
оснований производили методом колоночной хроматографии. Положение "пиков"
всех нормальных нуклеиновых оснований на хроматограмме было заранее
определено по ультрафиолетовому поглощению в тех же условиях разделения.
Метилированные миноры выходили из колонки отделенными от четырех нормальных
оснований. Положение "пиков" миноров, зафиксированное по радиоактивности, на
всех хроматограммах было неизменным. Активность соответствующих метилаз
оценивали по величине радиоактивности, измеренной в каждом из "пиков"
соответствующих миноров.
В результате было обнаружено, что относительная активность различных
метилаз (производящих разные миноры) зависит от выбора их источника: мы
сравнивали нормальную бактерию E.coli, печень крысы, гепатому Новикова,
молочную железу коровы. Еще зависит от степени кислотности инкубационной
среды, от концентрации в ней ионов магния и от соотношения количеств тРНК и
ферментной фракции. Вплоть до 6 часов инкубации включение радиоактивного
метила увеличивалось пропорционально времени. Все опыты дублировались для
проверки воспроизводимости результатов. Для каждого из источников метилаз на
основании этих опытов определяли оптимальные условия инкубации in vitro.
Описанные опыты заняли у нас с Полиной два года, 71-й и 72-й.
Покончив с этим довольно значительным объемом работ, я счел поручение
заведующего лабораторией выполненным (впрочем, его это уже не интересовало)
и начал готовиться к экспериментам по проверке своей гипотезы.
Но сначала небольшое отступление в сторону.
Я не случайно упомянул об утрате Баевым всякого интереса к метилазам.
После своего щедро вознагражденного триумфа его группа за прошедшие с тех
пор два года развалилась. Еще в 68-м году Ученый секретарь президиума
Академии наук Г.К. Скрябин, совмещавший эту должность с руководством
Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов в недавно созданном научном
городке Пущино (близ Серпухова), предложил Баеву организовать в нем
биохимическую лабораторию. Скрябина и Баева к этому времени связывали тесные
дружеские отношения. Предложение было принято. Александр Александрович
получил в Пущине большую квартиру и значительную часть времени проводил там,
на лоне природы. К тому же в 71-м году он был избран академиком-секретарем
Отделения биофизики и биохимии Академии, что также отнимало у него немало
времени. В ИМБ он заглядывал редко.
Самый сильный сотрудник команды, расшифровавшей структуру тРНК, Андрей
Мирзабеков, повозился с ней еще с полгода, стараясь выяснить функции
отдельных фрагментов этой молекулы. Потом отбыл на длительную стажировку в
Англию. Вернулся, увлеченный совсем иной проблемой - пространственной
организацией ДНК у высших животных. По-видимому, с согласия Баева, для
которого столь сильный сотрудник да еще с малознакомой ему тематикой был
неудобен, Андрей отделился и возглавил свою собственную лабораторию.
Татарская и Аксельрод эмигрировали. "Рабочие лошадки" - лаборантки вслед за
Баевым перебрались в Пущино, где тоже получили жилье. Из всей славной
команды, занимавшейся строением тРНК, осталась одна Татьяна Владимировна
Венкстерн. Будучи человеком уже пожилым, привыкшим всю жизнь работать под
авторитетным руководством - то Энгельгардта, то Баева, она не попыталась
найти для себя какое-то новое направление исследований. Как всеми уважаемый
и давний сотрудник директора Института, она взяла на себя заботу об
иностранных научных связях, организацию международных симпозиумов и
конференций.
Между тем в 72-м году появилась публикация американских ученых о первых
успехах получения "рекомбинантных ДНК". Это было начало эпохи "генной
инженерии". Суть этого направления в том, что был найден способ "разрезания"
в заранее определенном месте двойной спирали молекулы ДНК одной бактерии и
вживления в разрез фрагмента ДНК из другой бактерии - какого-нибудь ее гена.
Например, в ДНК безобидной обитательницы желудка человека, "кишечной
палочки", можно было надеяться встроить смертоносный ген бактерии чумы. Всем
было ясно, что это путь создания необоримого оружия биологической войны.
Кишечная палочка сохраняла свой "внешний облик" и потому была неотличима и
неуязвима для собственной иммунной системы человека. До того момента, пока
спрятанный в ее ДНК смертоносный ген не обнаруживал себя выработкой
страшного яда. Работы в этом направлении должны были получить неограниченную
финансовую поддержку от министерств обороны как у нас, так и в США. Авторы,
открывшие возможность генной инженерии, понимали к каким губительным
последствиям может привести их открытие. Они предложили наложить запрет на
развитие этих работ до тех пор, пока человечество не будет к этому морально
подготовлено. Сами объявили, что прекращают свои исследования. Но не тут-то
было! Ученые рангом ниже тут же вцепились в генную инженерию. В том числе и
Баев. Предлагал и мне заняться генной инженерией. Но, понимая, что это -
подготовка бактериологического оружия, я категорически отказался. После чего
наши отношения стали натянутыми.
Вообще, за последние несколько лет Александр Александрович стал
неузнаваем. Исчезло с лица выражение неизменной доброжелательности, исчезла
готовность помочь всем и каждому. Следа не осталось от приветливой, так
располагавшей к нему улыбки. Время от времени в кабинете заведующего
лабораторией появлялся мрачноватого вида, сухой и желчный начальник,
чиновник высокого ранга. К счастью, на меня он не обращал никакого внимания.
Дело ограничивалось легким кивком при случайной встрече в коридоре.
Как можно было объяснить эту метаморфозу? То ли на него столь роковым
образом повлияло высокое служебное положение, почет и власть, с ним
связанные, то ли его былые доброта и обаяние были лишь маской, надетой еще
во время пребывания "в местах отдаленных". В пользу второго предположения
могло говорить то, что выяснилось из его посмертно опубликованной биографии.
Ни на лесоповале, ни в шахте, ни на каких-либо еще тяжелых работах он
никогда не был. Три года отсидки в вологодской и соловецкой тюрьмах, а потом
работал врачом. Сначала в Норильском лагере, потом в больнице Норильского
металлургического комбината. Во время второй ссылки в течение пяти лет
заведывал сельской больницей в Красноярском крае.
Возможно также, что он так изменился под воздействием страха, который
ему пришлось пережить (все еще улыбаясь) в 68-м году. Работа по расшифровке
структуры тРНК подходила к концу. Радужные перспективы славы и почета,
наверное, уже рисовало воображение ее руководителя, когда случилось
вторжение советских войск в Чехословакию. В связи с ним семеро диссидентов,
чьи имена были названы в газетах, вышли на Красную площадь и развернули
плакат с протестом против этого вторжения. Они были немедленно арестованы.
Но никто не знал тогда, что их было не семь, а восемь. Восьмой была дочь
Александра Александровича Баева. Это обстоятельство в один миг могло
оборвать восхождение на академический Олимп в то время еще малоизвестного
кандидата наук. Но чья-то могучая рука вычеркнула юную протестантку из
"преступного" списка. Нет сомнения, что эту руку мог направить (конечно, не
непосредственно) только Энгельгардт. Вероятно, в течение какого-то времени
дело находилось в подвешенном состоянии и Баев, как говорится, натерпелся
страху.
Тем более, что он уже с 64-го года был членом КПСС. В своей
автобиографии, написанной за год до смерти, в 93-м году, Александр
Александрович объясняет мотивы своего поступка. Мне они показались столь
любопытными, что я решил воспроизвести их здесь.
"Сколько неприятностей и затруднений я испытал в 20-е годы из-за
имеющего формальное значение факта, что отец мой был не рабочим, не
крестьянином, а адвокатом. В 1954 году с меня сняли обвинение в терроризме,
но это была реабилитация судебная. Не существовало полной уверенности, что в
какой-то момент партийные или общественные круги не придут к заключению, что
судебная реабилитация полностью не обеляет лиц с прошлым, подобным моему.
Легко можно придумать даже несколько вариантов обоснования такого мнения. Ни
идеологических, ни карьерных мотивов у меня не было, когда я получил красную
книжку как свидетельство благонадежности. Я хотел крошечной свободы,
возможности жить, как это меня устраивало. В нашей стране деспотический
режим узурпировал у людей право на жизнь. И тот, кто хотел жить и
действовать, должен был это право купить за ту или иную цену. Здесь не место
заниматься вопросом, чему равна эта цена и следует ли ее платить. Для меня в
1964 г. этой ценой было вступление в партию. Можно по-разному судить о моем
поступке, но я заплатил этот выкуп. Конечно, во всем сказанном звучат нотки
самооправдания, от этого не уйти".
"Академик Александр Александрович Баев"
М.: "Наука", 1997, с. 29.
Но я, кажется, слишком отвлекся. Пора вернуться к моим научным делам.
Итак, в сложившейся ситуации я был совершенно свободен делать все, что мне
угодно, но ни на чью поддержку рассчитывать не мог.
Теперь уместно будет изложить в общих чертах мою гипотезу. Она должна
была ответить на три вопроса, оставшихся без внимания ученых:
Каким образом происходит необходимая смена ферментов в покоящихся
клетках высших организмов?
Используется ли как-нибудь избыточность генетического кода?
Какую роль играют минорные нуклеотиды в тРНК?
Первый вопрос нуждается в пояснении. Описанный ранее прямой путь
передачи информации от гена в ДНК через информационную РНК к рибосоме был
хорошо изучен у бактерий. Напомню, что ДНК бактерии относительно свободно
умещается в ее клетке, не образуя многократно скрученных, тугих структур,
входящих в состав хромосом высших животных. Изменение состава питательных
веществ, попадающих извне в любую клетку, или изменение ее состояния в ходе
развития и специализации требует быстрой смены ферментов, работающих в ее
цитоплазме. У бактерий это происходит просто. Приходящий извне химический
"сигнал" запускает считывание РНК-полимеразой легкодоступного нужного гена.
Информационная РНК приносит копию гена к рибосоме. Немедленно начинается
синтез нужного фермента, позволяющего усвоить принесенное кровью новое
питательное вещество. Операция повторяется до тех пор, пока в клетке не
окажется достаточное количество этого фермента. Если в силу смены питания он
и соответствующая ему информационная РНК оказываются ненужными, они
разрушаются другими ферментами, специально существующими для этой цели в
клетке. На их место поступают другие, нужные в новых условиях информационные
РНК и ферменты.
Такая же смена должна происходить в клетках высших животных, хотя бы по
причине изменения потребляемой пищи. Но добираться каждый раз до глубоко
спрятанного в плотной упаковке ДНК нужного гена у этих организмов слишком
трудно.
Отсюда первое предположение моей гипотезы состояло в том, что в
нормальных условиях существования клеток высшего организма, в длительном
покое, все могущие потребоваться информационные РНК уже находятся в
цитоплазме. Они синтезируются и выходят в нее из ядра во время деления
клетки, когда структура ДНК расслаблена. В цитоплазме эти информационные РНК
хранятся до момента их использования защищенные специальными белками от
ферментов-разрушителей ("чистильщиков"). Подобные структуры, названные
"информосомами", были обнаружены в начале 70-х годов. Для решения задачи
временной наработки большого количества какой-то одной из информационных РНК
я вынужден был предположить возможность копирования информационных РНК, то
есть синтеза РНК по матрице РНК. (Такой вид матричного синтеза обнаружен
совсем недавно.)
Что касается второго вопроса - возможности использования избыточности
генетического кода, то она может послужить клетке высшего организма для
регулирования относительной скорости синтеза различных белков. На уровне
"прочтения" в рибосоме последовательности нуклеотидов, доставленной
информационной РНК.
Дело в том, что избыточность генетического кода оказалась далеко не
равномерной. Когда я писал ранее, что для кодирования 20 аминокислот
остается 61 кодон, можно было предположить, что, как правило, каждой
аминокислоте соответствуют три кодона. Но это не так. Три аминокислоты
"имеют" по 6 кодонов каждая. Пяти другим аминокислотам соответствует по 4
кодона. На долю остальных 12 аминокислот остается 23 кодона. И все они
"разобраны", то есть кодируют аминокислоты - в большинстве случаев по два
кодона на каждую.
Кстати, это обозначает и избыточность числа различных тРНК. Их должно
быть как минимум столько же, сколько "активных" кодонов, то есть 61.
Транспортные РНК, приносящие одну и ту же аминокислоту к разным кодонам
называют "изоакцепторными тРНК" для этой аминокислоты. (Они все присоединяют
к своему концу - "акцептируют" одну и ту же аминокислоту.) Прошу читателя
запомнить смысл этого названия изоакцепторные тРНК. В дальнейшем мы часто
будем иметь с ними дело.
Теперь к существу гипотезы. Предположим, к примеру, что аминокислота
"серин", у которой 6 различных кодонов, в информационной РНК,
предназначенной для синтеза некоего белка А, закодирована одним из этих
шести кодонов (присвоим ему No 1). Если в цитоплазме клетки отсутствует
"зрелая" изоакцепторная тРНК серина, способная "узнать" этот кодон (или ее
очень мало), то синтез белка А окажется невозможен (или чрезвычайно
замедлится). Наш "злополучный" кодон No 1 будет играть роль "модуляторного
кодона", постулированного Эймсом и Хартманом. Во всех прочих белках серин
может быть закодирован любым из остальных пяти его кодонов. И если для них
имеются в достаточном количестве зрелые изоакценпторные тРНК, то все эти
белки будут синтезироваться с нормальной скоростью. Впрочем, поскольку у
серина целых 6 кодонов, замедление может в разной степени коснуться
нескольких белков - получается целая гамма скоростей синтеза
серин-содержащих белков, управляемая пропорцией наличествующих в клетке
дееспособных ("зрелых") изоакцепторных тРНК серина.
Те же "игры" могут разыгрываться для белков, использующих другие
избыточные кодоны, для других аминокислот.
Для завершения рабочей гипотезы (и ответа на 3-й вопрос) остается
предположить, что "зрелость", дееспособность любой тРНК определяется
полнотой ее "миноризации", полнотой набора "положенных ей" миноров. Мы
знаем, что первоначально тРНК синтезируется как цепочка нормальных
нуклеотидов. Миноризация происходит потом, в цитоплазме, благодаря
активности метилаз и других модифицирующих ферментов. Это означает, что
управление скоростями биосинтеза ферментов и прочих белков переносится на
уровень соотношения активностей различных метилаз и других модификаторов.
(Число их должно отвечать числу разных тРНК и необходимому количеству
модификаций в каждой из них.) Но активизация или угнетение активности
различных ферментов может зависеть от веществ, поступающих в клетку извне,
из крови. Например, необходимых низкомолекулярных "помощников" ферментов.
Иногда эту роль играют ионы определенных металлов или простые молекулы
некоторых витаминов.
Подтверждение этой гипотезы открыло бы колоссальные новые перспективы
для медицины, поскольку многие заболевания связаны с нарушениями пропорций
биосинтеза белков в клетках, определяющих функционирование важных для
жизнеспособности органов. А иногда причиной болезни может служить отсутствие
синтеза некоего белка или наоборот - синтез белка вредного. Гипотеза дает
надежду на возможность управления всеми этими отклонениями от нормы извне,
через кровь или лимфу. Притом не чисто эмпирически, а сознательно:
воздействуя на активность модифицирующих тРНК ферментов. (Разумеется, для
этого они должны быть выделены и изучены.)
Но каким образом полнота "миноризации" молекулы тРНК может влиять на ее
дееспособность? Ответ, по-видимому, надо искать в механизме взаимодействия
несущей аминокислоту тРНК с рибосомой. Уже упоминалось, что молекулы тРНК
складываются и приобретают некую пространственную конфигурацию. В ее
образовании должны играть свою роль миноры. Сама же эта конфигурация может
быть необходима для того, чтобы занять нужную позицию на рибосоме. Из этого
предположения неявно вытекает еще и возможность того, что сама рибосома
"дышит" - слегка меняет конфигурацию "места узнавания" в зависимости от
приходящего в него кодона. Недаром же рибосома представляет столь сложное
образование (в нее входит несколько десятков белков и специальные
"рибосомные РНК").
Вот такова гипотеза. Но как приступить к поиску ее подтверждения?
В первую очередь надо было найти объект исследования, который можно
изучать в двух физиологически различных состояниях с тем, чтобы сравнить
наборы изоакцепторных тРНК в каждом из них. Затем можно было бы провести
реакцию синтеза белков in vitro, совмещая в ней информационную РНК и
ферментную систему из одного состояния с набором всех тРНК из другого
состояния. Проанализировать весь спектр белков, синтезируемых в такой
гетерогенной системе, и сравнить его с наборами белков, синтезируемых в
гомогенных системах, когда информационные РНК, ферменты и тРНК были бы взяты
из одного и того же состояния. Быть может, таким образом удалось бы
показать, что набор синтезируемых белков действительно определяется набором
дееспособных тРНК.
К счастью, такой во всех отношениях удобной объект уже существовал и
физиологически был хорошо изучен. Его за несколько лет до того отыскал
заведующий одной из лабораторий Института биологии развития, молодой, но
очень талантливый исследователь Саша Нейфах. Я был с ним хорошо знаком.
Этим объектом служила маленькая рыбка вьюн, похожая на очень короткого
(не более 30 см в длину) угря. Вьюны водятся в нашей средней полосе,
особенно в старицах рек и в других неглубоких и стоячих водоемах. Их Саше
пару раз в месяц привозил в двух больших бидонах (самцы и самки отдельно)
очень колоритный, высокий и жилистый старик. Он знал. наверное, все места в
центральной России, где водится вьюн. Держал их в секрете. Теперь и я стал
его клиентом. В оплату за труды старика зачислили в Институт лаборантом.
Вьюны предпочитают температуру не выше 20оС. Я их хранил в
нескольких больших пластмассовых баках для белья, штук по 50 в каждом, в
"холодной комнате" при +4оС. Там они благополучно дремали до
очередного опыта. Кормить их не было нужды - только ежедневно менять воду.
Отработанная Нейфахом процедура получения оплодотворенной икры была
достаточно простой. Самкам вкалывали половой гормон хориогонин и через 39
часов пребывания при температуре +17оС легко выдавливали из них
икру в плоскую и неглубокую стеклянную чашку с небольшим количеством воды.
Заблаговременно, вспоров брюшко у самцов, извлекали семенники, нарезали их
на мелкие кусочки, которые раздавливали в ступке с несколькими миллилитрами
слабого солевого раствора. В чашку с икрой через смоченную водой марлю
выдавливали экстракт из семенников. При осторожном перемешивании происходило
оплодотворение - икра явно набухала... Далее Саша следил за ранним развитием
зародышей в тех же чашках, помещая их в термостат при температуре
21,5оС. Время от времени чашки покачивали для улучшения аэрации.
Уже через 2 часа в бинокулярную лупу можно было видеть, как на поверхности
икринки появлялся первый "пузырек". Затем он делился надвое, потом еще
деление и так далее. На икринке нарастает "шапочка" (бластодерма). Это уже
зародыш. В течение первых 20 часов он проходит ранние стадии развития
(морула - бластула - гаструла). На глаз это заметно как увеличение
бластодермы и уменьшение размеров образующих ее клеток. Считается, что через
20 часов в зародыше начинаются процессы "органогенеза". Я не пытался
вникнуть в тонкости физиологической эволюции зародыша. Мне было достаточно
уверенности в том, что по мере его развития в клетках бластодермы начинают
синтезироваться новые, характерные для каждой последующей стадии белки. Эту
уверенность разделял и Нейфих. Открывалась возможность обнаруживать
изменения белкового состава и наборов тРНК в зародышах с разных стадий
развития.
Не устраивали меня только масштабы работы Нейфаха. Ему для наблюдений
достаточно было располагать икрой из трех-четырех рыб. А мне для
осуществления последующих операций фракционирования белков и тРНК надо было
запускать в процесс одновременного развития икру из, по меньшей мере,
полусотни рыб. Выращивание зародышей на чашках для этого не годилось. Из
нижней половины разрезанной стеклодувом 20-литровой бутылки от реактивов,
настольного малогабаритного вентилятора, жидкостного термостата и некоторых
вспомогательных устройств мне удалось соорудить прибор, в котором благодаря
непрерывной циркуляции 10 литров взвеси икринок в воде происходило
нормальное развитие зародышей. (Как ни странно, повторить эту конструкцию не
удалось никому, даже Нейфаху - у них икра не росла.)
Не буду описывать процедуры отделения и очистки бластодерм любой стадии
развития от "желтка" - самой икринки с ее запасом питательных веществ. Все
эти процедуры были отработаны Нейфахом. Важно то, что в результате удавалось
получить (в зависимости от стадии развития) от 2 до 5 грамм зародышевого
материала. Этого было достаточно для проведения всех многочисленных и тонких
операций по вскрытию клеток зародыша, извлечению из них нужных фракций,
постановке опытов in vitro и последующего анализа результатов этих опытов.
Ограничусь замечанием, что отработка всех методик и проведение самих
экспериментов потребовали от меня и моих двух лаборанток напряженной работы
в течение девяти лет. После чего постараюсь вкратце изложить полученные
результаты, разбив всю работу на три этапа.
Поскольку методика сопоставления активностей метилаз из разных
источников была уже отработана, решено было провести сравнительную оценку
активностей метилаз из разных органов вьюна и его зародышей на 10-часовой и
30-часовой стадиях развития. Соотношения этих активностей оказались бы
полезными на заключительной стадии исследования роли тРНК в регулировании
биосинтеза белков.
Полученные результаты обнаружили, что соотношения активностей
соответствующих метилаз для печени, сердца и мозга вьюна, а также его
зародышей сильно различаются между собой. Повторенный в эти же дни анализ
распределения активностей для печени крысы оказался совсем иным, чем для
печени вьюна.
Методически опыты ставились так же, как описано ранее: субъектом
метилирования служила суммарная тРНК из "дефицитных" по синтезу метильной
группы бактерий E.coli K12W6(CH3-). Радиоактивный метил включался
за счет того же 14С-SAM.
В другой серии опытов прослеживали динамику изменения активности
метилаз в зародышах вьюна в зависимости от времени их развития. Сопоставляли
стадии: 4,5; 7; 12; 20 и 27 часов роста. Различия в распределении
активностей метилаз были не столь резкими, как для разных тканей взрослого
вьюна, но заметные. При этом для некоторых метилаз можно было усмотреть
определенную постепенность изменения активности от одной стадии развития
зародыша к другой.
Обнаружение отличия в распределении активностей разных метилаз из
тканей одного и того же животного и тем более, его зародышей на разных
стадиях развития свидетельствовало в пользу предложенной гипотезы, но никак
еще не доказывало ее правильность.
Этот этап занял тоже около двух лет: 73-й и 74-й годы.
Любезный читатель, здесь я еще раз позволю себе небольшое отклонение от
темы. Неумолимая хронология заставляет меня отложить на время описание наших
исследований и отдать дань событию, случившемуся в нашей лаборатории в том
же 74-м году. Событие это повлияло не только на мою собственную судьбу, но и
на судьбу всего нашего Института.
В один прекрасный день Александр Александрович Баев сообщил нам, что
вскоре в лаборатории появится новый сотрудник, Костя Скрябин, сын
академика-секретаря президиума Академии наук (и, как я уже упоминал,
близкого друга Баева). Эта новость была с тревогой воспринята почти всеми
сотрудниками, еще остававшимися в лаборатории. К "барскому сыночку" они
заранее питали недоверие и неприязнь. Мне это казалось несправедливым.
"Костя не виноват, что родился в столь высокопоставленной семье, - убеждал я
моих коллег. - Быть может, он отличный парень. Давайте примем его дружески,